Protocol集合
差速离心法分离原代小鼠肝星状细胞
用戊巴比妥(2%) 和水合氯醛 (4%) 复合麻醉剂 0.15ml/只腹腔注射小鼠,70%酒精消毒小鼠胸腹部,打开腹腔。麻醉成功后将小鼠仰卧固定一于解剖板上,腹部备皮、消毒,打开腹腔,翻起肝脏及肠管,暴露门静脉及下腔静脉,寻及胆管及脾静脉并结扎,持 24G 静脉套管针由门静脉穿刺, 见回血后, 固定套管, 退内针(拔出针芯,将留置针一浮管插入至门静脉分叉下端,结扎固定导管)。缓慢灌注30 ml 37℃预温 PBS。 肝脏充盈后, 剪断肝下方下腔静脉作为流出通道。 待肝脏血液被冲尽后(持续灌注8一10min),灌注预热37°C的D-Hank''''s肝脏灌流液,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏由紫红色逐渐变成淡黄色,游离肝脏,完整取出肝脏后经暴露的肝静脉继续灌注D-Haiik''''s液,尽量将残余血液冲干净。将肝脏移入超净工作台中,采用体外酶灌注消化法进一步消化分离肝脏组织。将游离肝脏置于平皿中,经暴露的肝静脉反复灌注预热37°C的含酶Hank''''s液I (含0.05 %的胶原酶、0.1%链霉蛋白酶E溶液)15ml.(撕破肝脏被膜,轻轻抖动肝脏促使细胞脱落,37℃磁力搅拌5min(搅拌速度为200rpm/min)。(或将消化液及肝组织放入50 ml三角瓶中再次消化20-30分钟至瓶内液体不含块状物,成为均勻咖啡色细胞悬液,消化过程中使用磁珠搅拌、温度维持在37°C)。所得细胞悬液经70um(200目)滤网过滤,并用4°C的Hank''''s液冲洗降低消化酶作用。
将装有肝脏细胞悬液的硅化离心管25g离心5min,去除残余的肝实质细胞, 取上清液,400g离心10min,弃上清,沉淀物为富含肝脏非实质细胞的部分。用4°C的无血清DMEM培养液冲冼重悬,定容至20 ml。取2只50 ml的刻度离心管,每管加入10 ml的30% Percoll液,将细胞悬液缓慢铺在30% Percoll液层上方,每管10 ml 30% Percoll液+ 10 ml细胞混悬液,2500 rpm离心20 min。吸取中间细胞悬液层入50 ml刻度离心管,加入无血清DMEM培养液至50 ml,1750 rpm离心8 min,取沉淀。加入预热37°C的含血清的DMEM完全培养基至10 ml。(制备 Percoll 密度梯度离心液, 自上而下密度分别为 1.037 g/ml (25%) 和 1.049 g/ml (35%)。 将沉淀用 RPMI-1640 培养基重悬后, 缓慢加入已经制备的 Percoll 密度梯度离心液的最上层。2700 r/min, 4℃, 离心 20 min。 离心后, RPMI-1640 培养基与 20% Percoll 密度层中间, 白色分层即为 HSCs层 (图 1)。 用移液器吸咀小心吸取该层, 移至含抗生素的 RPMI-1640 培养基中,2 000r/min,4℃,离心 6 min。取沉淀与 RPMI-1640 培养基 (含 10%胎牛血清) 混匀制成细胞悬液,台盼蓝染色计数活细胞数。
张自力 8月26日 3 0 0

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