Protocol集合
肌原纤维蛋白氧化程度检测
1、肌原纤维蛋白的提取

肉样品,用5倍的提取缓冲液(0.1M NaCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA,10 mmol/L K2HPO4,pH 7.0)匀浆后离心(2000 g,10min),重复四次并在第四次离心前用四层纱布过滤并用0.1M的Hcl将pH调至6.0,最后得到的蛋白膏保存于冰盒中备用。蛋白浓度用双缩脲法测定。

2、蛋白氧化模型的制作

构建以下氧化体系:反应历程为Vc+Fe3+→Fe2+,Fe2++H2O2→⋅OH,FeCl3浓度为0.01mmol/L,抗坏血酸浓度为0.1mmol/L,H2O2浓度分别为0.5、1、5、10、20 mmol/L。肌原纤维蛋白分散于上述氧化体系中(最终质量浓度为40 mg/mL),在4℃条件下氧化24h后用1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA ) EDTA ) 终止。以上的氧化反应均在15 mmol/L 哌嗪-N,N''''''''''''''''-双(2-乙磺酸)(piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid,PIPES)0.6 mol/L的Nacl为缓冲溶液(pH 值6.0)中进行。空白对照为新鲜猪背最长肌中提取出来后,未加氧化剂直接于4℃放置24 h 的肌原纤维蛋白(在本试验中将H2O2 浓度定义为0)。

3、羰基值的检测

在1.5 mL的离心管中,加入0.1 mL的蛋白溶液与0.5 mL 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl 溶液,在25℃下反应40 min,空白样品中不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/LHCl。然后加入0.5 mL 质量分数为20%的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA),震荡后离心(11 000×g,5 min)弃上清,蛋白沉淀用2 mL 的乙醇-乙酸乙酯溶液(体积比为1:1)离心(11 000×g,5 min)洗涤3 次,挥发完溶剂后将蛋白质悬浮于1 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液(用0.1M Hcl调节pH至2.3)中,在37℃条件下水浴保温30 min。以空白为对照370 nm下测吸光值,蛋白质羰基衍生物的含量(nmol/mg•蛋白)使用摩尔吸光系数为22 000 L/(mol•cm)计算。蛋白浓度在溶解于盐酸胍后再次检测。
赵冰 8月31日 5 2 0

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