Protocol集合

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活动时间:即日起至2016年10月31日

乳粉中肌醇测定
称取适量乳粉,加入甲醇,水以及0.1%三氯乙酸混合提取液,定容至50ml,用离心机反复离心,至溶液澄清,取5ml澄清液用无水乙醇,反复旋转蒸发,除去水分,后加入硅烷化试剂5ml,水浴70度反应70分钟,后冷却,加入5ml正己烷提取,再离心至分层明显,取上清液进样。
张雷 9月21日 1 0 0

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Microsome Preparation
我实验室使用的是贝克曼台式低温离心机。将复苏后的肝细胞混悬液置于离心管中以140000 g (相当于 34000 rpm/min )4℃ 离心 24 h 去掉上清即可得到肝细胞中的微粒体。
朱晓岑 9月12日 3 1 0

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RNA提取自总结特别注意点
在提取多糖多酚较多的植物总RNA时,加入提取液后离心,需要去除蛋白及DNA,在抽取上层时宁少勿贪多。移液器操作要特别注意:吸力不要过大,以防搅拌中间层及下层液体而引起污染。
马志慧 9月4日 3 2 0

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肌原纤维蛋白氧化程度检测
1、肌原纤维蛋白的提取

肉样品,用5倍的提取缓冲液(0.1M NaCl,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA,10 mmol/L K2HPO4,pH 7.0)匀浆后离心(2000 g,10min),重复四次并在第四次离心前用四层纱布过滤并用0.1M的Hcl将pH调至6.0,最后得到的蛋白膏保存于冰盒中备用。蛋白浓度用双缩脲法测定。

2、蛋白氧化模型的制作

构建以下氧化体系:反应历程为Vc+Fe3+→Fe2+,Fe2++H2O2→⋅OH,FeCl3浓度为0.01mmol/L,抗坏血酸浓度为0.1mmol/L,H2O2浓度分别为0.5、1、5、10、20 mmol/L。肌原纤维蛋白分散于上述氧化体系中(最终质量浓度为40 mg/mL),在4℃条件下氧化24h后用1 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA ) EDTA ) 终止。以上的氧化反应均在15 mmol/L 哌嗪-N,N''''''''''''''''-双(2-乙磺酸)(piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid,PIPES)0.6 mol/L的Nacl为缓冲溶液(pH 值6.0)中进行。空白对照为新鲜猪背最长肌中提取出来后,未加氧化剂直接于4℃放置24 h 的肌原纤维蛋白(在本试验中将H2O2 浓度定义为0)。

3、羰基值的检测

在1.5 mL的离心管中,加入0.1 mL的蛋白溶液与0.5 mL 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl 溶液,在25℃下反应40 min,空白样品中不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/LHCl。然后加入0.5 mL 质量分数为20%的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA),震荡后离心(11 000×g,5 min)弃上清,蛋白沉淀用2 mL 的乙醇-乙酸乙酯溶液(体积比为1:1)离心(11 000×g,5 min)洗涤3 次,挥发完溶剂后将蛋白质悬浮于1 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液(用0.1M Hcl调节pH至2.3)中,在37℃条件下水浴保温30 min。以空白为对照370 nm下测吸光值,蛋白质羰基衍生物的含量(nmol/mg•蛋白)使用摩尔吸光系数为22 000 L/(mol•cm)计算。蛋白浓度在溶解于盐酸胍后再次检测。
赵冰 8月31日 5 2 0

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如何巧用离心机使淋巴细胞分离液分层更清晰
在使用淋巴细胞分离液分离全血或骨髓时,除了一定转速和离心时间外,还可以通过调节离心前后的提升速度来使分层更明显。通过反复试验证明,离心开始升速时,调节为7档;离心时间到开始降速时,调节为slow档,结果与升MAX降MAX相比,分层清晰明显很多。我实验室使用的是贝克曼台式低温离心机。
张君 8月30日 2 2 0

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Exosomes ( Exo)-Free 胎牛血清(FBS)制备
1)将商品化FBS于4℃融化并分装。
2)将上述FBS分装到超速离心管(Cat: #355618,Beckman)中,每管25 ml,100,000 g × 14-16 h(OPTIMAL-100XP;Rotor:70-Ti;Beckman),4℃。
3)离心后从超速离心管中轻轻取出,切勿摇动,利用移液器将90%上清液吸出到50 ml新无菌离心管(Corning)中。
注:不要倾倒,利用移液器贴着液面吸取,以避免搅动底部沉淀,剩余10%可用于细胞冻存或普通细胞培养实验。
4)将上述转移到新离心管中的FBS混匀后在超净台中使用0.22 μm滤器(Millipore)进行除菌,将滤出液转移到新的无菌离心管中进行分装,4℃保存(短期内使用,长时间储存请放置到-20℃保存)。
徐孝东 8月30日 8 4 0

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核酸抽提
50 μL样品中加入50 μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分震荡后,以12000 r/min离心5 min,抽提以除去体系中的蛋白,吸出上清液于另一干净的200 μL的离心管中,并加入与上清液等体积的氯仿,充分混匀后以12000 r/min离心5 min后,吸出上清液即为核酸溶液。
刘宇 8月29日 1 2 0

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Co-IP实验详细操作方案&血清分离实验方法
本实验全部操作均在贝克曼库尔特4度离心机中操作
Co-IP实验详细操作方案:
待验证互作的A和B质粒共转染细胞(转染实验步骤略)约48h后收集细胞样品,用PBS轻轻洗3遍,加入lysis buffer裂解液(已加入各种蛋白酶抑制剂和0.1M DTT)600µL,冰上裂解30min,用枪头轻轻吹下细胞裂解物吸入EP管中,4℃离心机12000rpm 10min,取出约60µL上清作为阳性对照,剩余上清转移至新的EP管中,按BCA法测定蛋白浓度。
预处理Protein G Beads:向EP管中加入琼脂糖G蛋白40µL,以及1%BSA封闭液500µL,4℃旋转摇床摇荡4h,然后Beads和1%BSA混合液4℃离心10000rpm 10s,弃去上清,再加入600µL lysis buffer,4℃旋转摇床润洗10min,然后4℃离心10000rpm 10s,弃上清,加入IP一抗约3µL和至少450µg总蛋白,4℃旋转摇床过夜,然后4℃离心10000rpm 10s,小心弃上清,加入500µL lysis buffer对Beads进行清洗,旋转摇床摇5min,4℃离心10000rpm 10s,最后留约20µL上清液,加入5×loading buffer 5µL,和阳性上清对照一起煮沸5min,跑SDS-PAGE,通过western blotting进行蛋白互作情况的检测。
血清分离实验方法:
由于本课题组涉及部分应用研究实验,因此常常采集动物血液样品进行相关实验的验证研究。采集来的血液一般是通过贝克曼库尔特4度离心机进行分离,首先是把采血器中的血液样品移至1.5mL离心管,然后在4度离心机中离心8000 rpm 4min,轻轻取出离心管,将上层血清移至新的EP管中,标记好编号、日期、动物种类,进行ELISE等后续检测。
王国庆 8月27日 234 4 2

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通过CsCl 等密度梯度离心纯化λ噬菌体颗粒实验
将噬菌体悬浮液转移至适宜于 Beckman SW50.1 转子(或相当型号)的一个或多个超离管中,加入 CsCl 溶液(ρ=1.5 g/ml 于 SM 中),160000 g ( 36000 r/min 于 Becrkman SW50.1 转子中)4℃ 离心 24 h。当离心完成后,如下面替代方案的步骤 3 和 4 所述收集噬菌体颗粒。
张再重 8月27日 3 1 0

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试剂中间体的获得
体外诊断试剂研发实验中试剂中间体的获得是实验的关键。研发实验过程中,高速稳定的离心机是不可或缺的得力助手。要把纳米级的试剂原料从悬浮液中离心下来可不是一件容易的事,并且在离心过程中不能对悬浮液中的蛋白造成损害,常常需要摸索最优的离心参数:转速,和离心时间等。目前,比较通用的参数是13000r/min,4℃,30min 。对于不同的试剂项目,特别是对于比较昂贵的试剂原料,离心参数还需要进一步摸索,积累。
廖文峰 8月26日 5 0 0

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差速离心法分离原代小鼠肝星状细胞
用戊巴比妥(2%) 和水合氯醛 (4%) 复合麻醉剂 0.15ml/只腹腔注射小鼠,70%酒精消毒小鼠胸腹部,打开腹腔。麻醉成功后将小鼠仰卧固定一于解剖板上,腹部备皮、消毒,打开腹腔,翻起肝脏及肠管,暴露门静脉及下腔静脉,寻及胆管及脾静脉并结扎,持 24G 静脉套管针由门静脉穿刺, 见回血后, 固定套管, 退内针(拔出针芯,将留置针一浮管插入至门静脉分叉下端,结扎固定导管)。缓慢灌注30 ml 37℃预温 PBS。 肝脏充盈后, 剪断肝下方下腔静脉作为流出通道。 待肝脏血液被冲尽后(持续灌注8一10min),灌注预热37°C的D-Hank''''s肝脏灌流液,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏由紫红色逐渐变成淡黄色,游离肝脏,完整取出肝脏后经暴露的肝静脉继续灌注D-Haiik''''s液,尽量将残余血液冲干净。将肝脏移入超净工作台中,采用体外酶灌注消化法进一步消化分离肝脏组织。将游离肝脏置于平皿中,经暴露的肝静脉反复灌注预热37°C的含酶Hank''''s液I (含0.05 %的胶原酶、0.1%链霉蛋白酶E溶液)15ml.(撕破肝脏被膜,轻轻抖动肝脏促使细胞脱落,37℃磁力搅拌5min(搅拌速度为200rpm/min)。(或将消化液及肝组织放入50 ml三角瓶中再次消化20-30分钟至瓶内液体不含块状物,成为均勻咖啡色细胞悬液,消化过程中使用磁珠搅拌、温度维持在37°C)。所得细胞悬液经70um(200目)滤网过滤,并用4°C的Hank''''s液冲洗降低消化酶作用。
将装有肝脏细胞悬液的硅化离心管25g离心5min,去除残余的肝实质细胞, 取上清液,400g离心10min,弃上清,沉淀物为富含肝脏非实质细胞的部分。用4°C的无血清DMEM培养液冲冼重悬,定容至20 ml。取2只50 ml的刻度离心管,每管加入10 ml的30% Percoll液,将细胞悬液缓慢铺在30% Percoll液层上方,每管10 ml 30% Percoll液+ 10 ml细胞混悬液,2500 rpm离心20 min。吸取中间细胞悬液层入50 ml刻度离心管,加入无血清DMEM培养液至50 ml,1750 rpm离心8 min,取沉淀。加入预热37°C的含血清的DMEM完全培养基至10 ml。(制备 Percoll 密度梯度离心液, 自上而下密度分别为 1.037 g/ml (25%) 和 1.049 g/ml (35%)。 将沉淀用 RPMI-1640 培养基重悬后, 缓慢加入已经制备的 Percoll 密度梯度离心液的最上层。2700 r/min, 4℃, 离心 20 min。 离心后, RPMI-1640 培养基与 20% Percoll 密度层中间, 白色分层即为 HSCs层 (图 1)。 用移液器吸咀小心吸取该层, 移至含抗生素的 RPMI-1640 培养基中,2 000r/min,4℃,离心 6 min。取沉淀与 RPMI-1640 培养基 (含 10%胎牛血清) 混匀制成细胞悬液,台盼蓝染色计数活细胞数。
张自力 8月26日 3 0 0

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培养血清中的外泌体微颗粒超离清除
一般细胞培养用的胎牛血清FBS中也含有牛体细胞自然分泌的大量胞外微颗粒(EVs,包括外泌体等),如果未能有效预先去除,将极大影响后续外泌体实验的准确性和可靠性。我们可以通过超速离心,在120,000 xg的RCF下,4℃超离过夜(18h),把血清中的各种微颗粒彻底沉淀干净。经实验验证,此方法的外泌体微颗粒残留量与商品化的无微颗粒血清相当,且对细胞培养效果无明显影响。
朱虹 8月22日 24 4 6

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